病毒转染效果不好？一文快速get高效转染小绝招
2021年10月26日/医麦客新闻 eMedClub News/--转染是指将外源基因如DNA、RNA等导入真核细胞的技术，作为基因治疗中的常规手段，由于其效率较低，已成为大批量生产的瓶颈环节之一。
在现有技术平台上，如何通过关键参数优化，最大化的提高转染效率成为了行业中的重要课题之一。而从生物工艺优化的角度看来，每一个生产环节都存在着一定的“设计空间”，只要控制参数在这个“设计空间”内，则允许材料的属性和工艺参数具有一定的变化浮动范围。
“设计空间”的存在给予了行业生产的灵活性，但也进一步证明了生物工艺的复杂性，确定一个最佳的试验条件范围绝非易事，需要对各条件和组合进行不断的测试。在这篇文章中，我们以LV（慢病毒）为例，对转染过程中的关键实验参数进行摸索总结，让你轻松get到转染小绝招。
实验条件：
1)细胞株：HEK293SF-3F6
2)反应器：一次性搅拌式反应器
3)截留装置：0.8-0.45 µm
4)培养方式：灌流培养
1、高的细胞密度可以
得到更高的病毒滴度
通过测试2个不同的细胞密度：LCD (Low Cell Density, 1×106cells/ml) 和HCD (High Cell Density, 5×106cells/ml) ，采用灌流的培养模式，使培养的细胞密度达到1×107cells/ml。
从图1中可以看到，转染后3天，病毒滴度达到峰值，在LCD条件下，病毒梯度约为1×106TU/ml，而在HCD条件下，病毒滴度峰值可达5×106TU/ml，病毒滴度与转染时的细胞密度成正比，即转染时的细胞密度越高，病毒滴度越高。
图1
转染阶段,细胞密度的提高有利于获得更高的病毒滴度。(A)病毒梯度,LCD(open bars)HCD(solid bars)。(B)细胞密度。总细胞计数(squares),活细胞计数(triangles)，HCD(solid symbols),LCD(open symbols)。
2、不同培养基对于
病毒滴度的影响很大
市面上存在着各种不同的培养基，其含有的成分及比例各有不同，那么不同的培养基对病毒滴度的影响到底有多大呢？我们测试了3种不同的培养基：某品牌的LC-SFM L; LC-SFM GL以及HyClone培养基SFM4Transfx-293(下文以HyQ代替)。
如图2所示：
在使用LC-SFM L和 LC-SFM GL时，
不论LCD还是HCD的条件下，单个细胞产毒效率均为2 TU/Cell。
在使用HyQ(SFM4Transfx-293)时，
LCD单个细胞产毒效率可高达6 TU/Cell，
而在HCD条件下单个细胞转染效率则减少为2 TU/Cell。这可能是因为在高细胞密度条件下，细胞严重结团，在容器液面边缘形成一圈死细胞。通过降低PEI的使用量，可进一步降低其对于细胞的毒副作用，将PEI从原来的1 µg DNA/106cells降低到0.4-0.6 µg DNA/106 cells PEI，转染后3天，最高病毒滴度为9×106 TU/ml。
图2
不同类型培养基对LV生产的影响。转染阶段:HCD条件下使用LC-SFM L培养基(solid grey bars),HCD条件下使用LC-SFM GL培养基(solid black bars),LCD条件下使用SFM4Transfx-293培养基(open bars),HCD条件下使用SFM4Transfx-293培养基(hatched bars)。
3、丁酸钠的浓度和作用时间
丁酸钠会促进转染，通常在转染后添加，我们通过测试不同丁酸钠浓度和作用时间对于病毒滴度的影响来给出最佳浓度范围参考：
如图3所示，HyQ (SFM4Transfx-293)培养基在HCD转染条件下转染，转染后16h添加丁酸钠，随着丁酸钠含量的增加，病毒滴度增加。在5 mM丁酸钠添加量条件下，转染后2天可达最大病毒滴度，为1×108TU/ml。
4、总结
在工艺优化中，转染受到多种因素的影响，在这里我们摸索了细胞密度、培养基和丁酸钠在转染过程中对病毒滴度的影响，通过条件优化，最终可以得到1×108 TU/ml的病毒滴度。而真正摸清不同细胞的“脾性”，为不同细胞模拟出最佳的适应环境，还需要更多的条件摸索。除了实验条件的摸索，利用新型技术平台，也将大幅度提高生产效率，如灌流技术、连续流、自动化等。
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